Federica Riva¹, Lucia A. Stivala², Monica Savio², Ornella Cazzalini², Livia Bianchi², Ennio Prosperi¹

In seguito a danno al DNA, la proteina p21^waf1/cip1, attivata da p53, induce l'arresto del ciclo cellulare nella fase G1, inibendo l'attività delle chinasi ciclina-dipendenti. p21 si trova associata a cicline e PCNA, un cofattore delle DNA polimerasi d ed e , implicate sia nella replicazione che nella riparazione del DNA. p21 svolge un ruolo importante nel meccanismo di riparazione per escissione nucleotidica (NER), poiché l'efficienza del NER è ridotta in cellule tumorali p21-deficienti. La reintroduzione di p21 ripristina l'efficienza del NER, mentre l'introduzione di p21 priva del dominio di legame per PCNA, porta alla riduzione della riparazione del DNA. Scopo di questo lavoro è di verificare come la mancanza di p21 influenzi il NER e, in particolare, come possa influenzare il reclutamento di PCNA ai siti riparativi. Per questo motivo, abbiamo utilizzato fibroblasti umani nei quali il gene p21 è stato deleto (p21-/-), e le rispettive linee parentali p21+/+ e p21+/-. Il saggio di sopravvivenza clonogenica ha mostrato che le cellule p21-/- sono circa 2 volte più sensibili alle radiazioni UV-C, rispetto alla linea parentale p21+/+. La maggior sensibilità delle cellule p21-/- agli UV-C è confermata dall'indice apoptotico, che è circa 5 volte maggiore rispetto alla linea parentale. L'analisi citometrica dei livelli di PCNA nelle varie fasi del ciclo cellulare non mostra significative variazioni nelle cellule p21-/- e p21+/+ in seguito all'irraggiamento con varie dosi di UV (2.5-20 J/m²). L'analisi della rimozione dei dimeri di timidina mediante immunoblot ha mostrato che le cellule p21-/- hanno una ridotta capacità riparativa. Questi risultati indicano che l'assenza di p21 non influenza il reclutamento di PCNA ai siti di riparazione del DNA. La ridotta efficienza del NER nei fibroblasti p21-/- è quindi da imputarsi ad altri fattori.