A.C. Croce¹, M.G. Bottone², S. Barni², C. Pellicciari², G. Bottiroli¹

L'impiego di tecniche citochimiche di doppia colorazione basate su coppie di coloranti con opportune caratteristiche spettrali consente l'attivazione di processi di trasferimento di energia di fluorescenza di risonanza (FRET). Poiché l'efficienza di tali processi dipende dalla disposizione geometrica reciproca delle molecole di donatore ed accettore, l'uso di marcanti fluorescenti con elevata specificità per le biomolecole target permette di ottenere utili informazioni sull'organizzazione supramolecolare di strutture cellulari attraverso l'analisi FRET. Nel presente studio viene presentata un'applicazione delle tecniche FRET allo studio delle variazioni dell'organizzazione della cromatina in singole cellule conseguenti a momenti funzionali diversi. In particolare sono stati considerati: i) fibroblasti umani in coltura in stato quiescente (G0) e in stato pre-replicativo (G1), in cui vengono attivati geni specifici per la progressione nel ciclo cellulare; ii) timociti di ratto in coltura in condizione normale e di apoptosi spontanea o indotta per trattamento farmacologico (etoposide), con la tipica condensazione della cromatina, conseguenza del distacco degli istoni e delle rotture del DNA. Come coppia donatore/accettore sono stati usati i coloranti per il DNA l'Hoechst 33258 (nonintercalante A/T-specifico) e Ioduro di Propidio (intercalante base-aspecifico). L'analisi FRET è stata eseguita mediante tecniche microspettrofluorimetriche e di imaging di fluorescenza. Ogni particolare stato funzionale cellulare è stato caratterizzato mediante impiego di specifiche tecniche marcatura immunocitochimica e di analisi ultrastrutturale. Variazioni di efficienza FRET, significative di modificazioni nell'organizzazione della cromatina, in termini di condensazione/compattazione, sono state evidenziate nel confronto delle diverse situazioni funzionali considerati, sia come valori medi per le singole cellule (analisi spettrale) sia nella distribuzione topografica (imaging). Poichè le modificazioni strutturali della cromatina precedono nel tempo l'espressione dei processi significativi dei diversi stati funzionali (i.e. trascrizione genica o attivazione di endonucleasi), l'analisi del FRET consente di cogliere le fasi precoci delle variazioni funzionali delle cellule.